Fluorescentno rezonantni energetski transfer

Fluorescentno rezonantni energetski transfer (FRET) je prenos kvanta energije sa mesta apsorpcije na mesto iskorišćenja u molekulu, ili u sistemu molekula, bez emitovanja zračenja, kroz rezonantnu interakciju između hromofora preko rastojanja koje je znatno veće od interatomskog, bez konverzije u toplotnu energiju i bez donorsko akceptorskih kinetičkih sudara. Donor je obojeni molekul koji početno apsorbuje energiju, dok je akceptor hromofora na koju se zatim prenosi energija. FRET se drugačije naziva i Forsterov energetski transfer, jer ga je nemački naučnik Teodor Forster (Theodor Förster) prvi uočio i matematički formulisao.

Fluorescentno obeležena guanozin 5'-trifosfat hidrolaza (ARF) ukazuje na proteinsku lokalizaciju Golgdžijevog aparata živog makrofaga.

S obzirom da rastojanje između donora i akceptora mora da bude između 1 i 10 nm (odnosno između 10 i 100 Ǻ) da bi došlo do prenosa energije i da je efikasnost prenosa zavisna od rastojanja između fluorofora, rezonantni energetski transfer može biti pouzdano sredstvo za ispitivanje molekulskih interakcija.

Mehanizam fluorescentno rezonantnog transfera energije uključuje donorsku fluoroforu u pobuđenom stanju, koja može preneti svoju ekscitovanu energiju ka susednoj akceptorskoj hromofori, bez emitovanja zračenja, kroz dipol-dipol interakcije dugog dometa. Teorijsko razmatranje energetskog prenosa je bazirano na konceptu koji tretira pobuđenu fluoroforu kao oscilatorni dipol koji može podneti razmenu energije sa drugim dipolom koji ima sličnu rezonantnu frekvenciju. U tom kontekstu, rezonantni prenos energije je analogan ponašanju kuplovanih oscilacija, kao na primer par zvučnih viljuški koje vibriraju istom frekvencijom. Sa druge strane, prenos energije uz emitovanje zračenja zahteva emisiju i reapsorpciju fotona i zavisi od fizičkih dimenzija i optičkih svojstava uzorka, kao i od pravca rasprostiranja elektromagnetnih talasa. Za razliku od prenosa energije uz emitovanje zračenja, proučavanjem rezonantnog prenosa energije mogu se dobiti informacije o strukturi za dati par donora i akceptora.

Efikasnost prenosa energije obrnuto je srazmerna šestom stepenu rastojanja između molekula donora i akceptora. Usled toga, FRET merenja mogu biti iskorišćena kao efektivna metoda za određivanje rastojanja između molekula označenih kao odgovarajući donor i akceptor, kada se oni nalaze na rastojanju od najmanje 1 nm.

Donori i akceptori energije

Slika 1. Dijagram Jablonskog ilustruje sve kuplovane prelaze koji postoje između emisije donora i apsorpcije akceptora prilikom fluorescentno rezonantnog energetskog transfera.

Donor energije je po pravilu fluorescentni molekul. Kada svetlost određene talasne dužine (250 – 500 nm) pobudi molekule donora, njegovi elektroni prelaze sa osnovnog (S_O) na više vibracione nivoe (S₁, S₂, S₃, itd). U vrlo kratkom vremenu, reda veličine pikosekunde, ovi elektroni se zatim relaksiraju, tj. prelaze na najniži od pomenutih vibracionih nivoa (S₁), a zatim znatno sporije (reda veličine nanosekunde) se vraćaju na jedan od S_O nivoa, emitujući foton čija je talasna dužina veća od talasne dužine svetlosti koja je ekscitovala molekule donora (Slika 1.)

Kada su molekuli donora u ekscitovanom stanju, dolazi do rezonantnog prenosa energije ka hromofori, tj. akceptoru, koji se nalazi u neposrednoj blizini. Rezultujući emisioni spektar akceptora nakon takvog energetskog prenosa ima veoma slične karakteristike kao njegov početni emisioni spektar.

U većini slučajeva, donor i akceptor su različito obojeni molekuli, i tada se FRET može detektovati po pojačavanju emisije akceptora, ili pak po slabljenju emisije donora.

Da bi uopšte došlo do rezonantnog transfera energije neophodno je ispuniti nekoliko osnovnih uslova: • Molekuli donora i akceptora moraju biti u neposrednoj blizini (približno od 1 do 10 nm); • Apsorpcioni spektar akceptora se mora preklopiti sa emisionim spektrom donora (Slika 2.); • Tranzicioni dipoli donora i akceptora moraju biti približno paralelno orijentisani; • Donor energije mora imati veliku vrednost za kvantni doprinos.

Ukoliko je veći stepen preklapanja odgovarajućih spektara i što je bolja paralelna orijentacija tranzicionih dipola donora i akceptora, to će fluorescentni transfer energije biti favorizovan u odnosu na relaksaciju fluorescencije donora.

Matematička formulafija FRET-a

Ekscitovana energija elektrona može efikasno biti preneta između fluorescentnog donora energije i pogodnog energetskog akceptora preko distance veće od 10 Å. Godine 1948. nemački naučnik Teodor Forster predstavio je teoriju dipol-dipol energetskih transfera po kojoj je konstanta brzina prenosa energije, kt, obrnuto proporcionalna šestom stepenu rastojanja između donora i akceptora:

$k_{t}=8.71\times 10^{23}\;\ r^{-6}\,\kappa ^{2}\,n^{-4}\,k_{F}\,J$,

Geometrijske promenljive veličine u gornjem izrazu su: r – rastojanje između centara donorske i akceptroske hromofore;

$\kappa ^{2}$ – orijentacioni faktor za dipol-dipol interakcije.

Spektroskopske promenljive su:

J - integral preklapanja spektara (definisanim u daljem tekstu);

n - indeks refrakcije medijuma;

k_F - konstanta brzine fluorescentne emisije zračenja donora;

Zavisnost između efikasnosti prenosa energije, E, i rastojanja između donora i akceptora, R, je data jednačinom:

$E={\frac {1}{(1+(r/R_{0})^{6})}}\!$

gde je R_O Forsterovo rastojanje, koje predstavlja ono rastojanje između donora i akceptora za koje je efikasnost energetskog prenosa 50% (tj. 50% ekscitovanih donora je deaktivirano energetskim prenosom).

Ro (Å) se može izračunati pomoću:

${R_{0}}^{6}=8.8\times 10^{23}\;\kappa ^{2}\,n^{-4}\,Q_{d}\,J$

gde je Q_d kvantni doprinos fluorescencije donora energije u odsustvu akceptora i predstavlja spektroskopsku promenljivu (ostale veličine su prethodno definisane), dok se integral preklapanja može izračunati prema sledećoj formuli:

$J=\int f_{\rm {D}}(\lambda )\,\epsilon _{\rm {A}}(\lambda )\,\lambda ^{4}\,d\lambda$

gde je λ talasna dužina svetlosti, ε_A(λ) molarna apsorptivnost akceptora na datoj talasnoj dužini, a f_D(λ) emisioni spektar donora normalizovan po talasnoj dužini:

$f_{D}={\frac {f_{\rm {Dlambda}}{(\lambda )}}{\int f_{\rm {Dlambda}}{(\lambda )\,d\lambda }}}$

f_Dlambda (λ) je emisija donora po jedinici intervala talasne dužine.

Efikasnost energetskog prenosa, E

Efikasnost energetskog prenosa može biti određena na tri različita načina:

• Iz vremena života eksitovanog stanja donora u odsustvu ($\tau '_{\rm {D}}$) i prisustvu ($\tau _{\rm {D}}$) akceptora.

$E=1-{\tau '_{\rm {D}}}/{\tau _{\rm {D}}}\!$

• Iz kvantnog doprinosa donora u odsustvu ($F'_{\rm {D}}$) i prisustvu akceptora ($F_{\rm {D}}$).

$E=1-{F'_{\rm {D}}}/{F_{\rm {D}}}\!$

• Iz emisionih spektara donora, akceptora i dvosloja (odnosno relativnog emisionog intenziteta).

Efikasnost energetskog prenosa određena metodama 1 i 2 je definisana pod pretpostavkom da nanošenje sloja akceptora na sloj donora ne menja kvantnu efikasnost donora. Drugim rečima, lokalno okruženje donora mora biti identično i u odsustvu i u prisustvu akceptora.

BRET

Ograničenje FRET-a je zahtev za spoljašnjom iluminacijom da bi se inicirao fluorescentni transfer, što može da dovede do pozadinskog šuma u merenjima usled direktne ekscitacije akceptora ili fotoizbeljavanja. Da bi se izbegao ovaj nedostatak, bioluminescentno rezonantni energetski transfer (ili BRET) je razvijen. Ta tehnika koristi bioluminescentnu luciferazu (tipično luciferazu iz Renilla reniformis) umesto CFP-a za proizvođenje inicijalne fotonske emisije.

FRET i BRET su isto tako uobičajeni metodi u studiranju biohemijske reakcione kinetike i molekularnih motora.

Literatura

• Alexander Hillischa, Mike Lorenzb, Stephan Diekmann (2001). „Recent advances in FRET: distance determination in protein–DNA complexes”. Current Opinion in Structural Biology 11 (2): 201–207. DOI:10.1016/S0959-440X(00)00190-1. 

Spoljašnje veze

• Biotek
• Olympus Microscopy Resource Center Arhivirano 2011-07-16 na Wayback Machine-u