Imunohemijske metode – razlika između verzija
Uklonjeni sadržaj Dodani sadržaj
m Vraćene izmene korisnika 95.180.13.201 na poslednju izmenu korisnika Duma |
|||
Red 111:
Imunonefelometrija je aplikacija nefelometrije za određivanje koncentracije antigena. Nefelometrija je optička metoda kojom se meri intenzitet svetlosti rasute od strane partikula suspendovanih u fluidu ili makromolekula u rastvoru. Zasniva se na svojstvu razblažene suspenzije mikropartikula da rasipa svetlost. Inicijalni antigen-antitelo kompleksi su makromolekuli koji ne rasipaju svetlost. Međutim, ovi kompleksi imaju sposobnost da formiraju aggregate. Veličina agregata raste u toku nekoliko minuta do nekoliko sati dok njihova sposobnost da rasipaju svetlost ne dostigne maksimum. Ukoliko se koncentracija jednog reaktanta održava na konstantnom nivou, onda će stopa rasipanja svetlosti rasti sa rastućom koncentracijom drugog reaktanta, do dostizanja maksimalne vrednosti. Rasuta svetlost se sakuplja i meri u detektoru pod određenim uglom (najčešće 13-24<sup>ο</sup>). Bilo porast stepena rasipanja svetlosti bilo maksimalna vrednost se mogu kalibrisati za različite koncentracije reaktanata radi dobijanja kalibracione krive. Nepoznate koncentracije se onda mogu određivati merenjem odgovora i upoređivanjem sa standardnom krivom.
U slučaju viška antitela, koncentracija solubilnih imunih kompleksa merena posredstvom intenziteta rasute svetlosti je proporcionalna koncentraciji antigena. U slučaju viška antigena veličina solubilnih imunih kompleksa opada sa porastom koncentracije antigena, a na osnovu izmerenog signala stiče se pogrešna slika o niskoj koncentraciji antigena. Stoga se uzorak koji sadrži ciljni antigen razblažuje do uspostavljanja koncentracije koja spada u domen rastućeg dela Heidelbrerg-Kendall-ove krive, dok test reagens sadrži konstantnu količinu specifičnih antitela.
'''Princip:''' formiranje imunskih kompleksa se meri u nefelometru nakon dodavanja pufera, specifičnog antiseruma i uzorka koji sadrži ciljni protein. Laserski snop svetlosti usmeren kroz kivetu biva rasut od strane imunskih kompleksa. Električni signal koji se sistemom sočiva usmerava ka fotodetektoru je proporcionalan intenzitetu rasute svetlosti i konvertuje se u koncentraciju proteina korišćenjem standardne krive. Zavisno od geometrijskog aranžmana detektora detektuje se samo deo rasute svetlosti. Talasna dužina svetlosti i veličina partikula determinišu optimalni ugao za merenje.
Svetlost rasuta od strane antigen-antitelo kompleksa se može meriti:
* po završetku reakcije tzv. End-point metodom kada se dozvoljava reakciji da se odigra tokom definisanog vremena npr. 15-30 minuta i meri se maksimalan odgovor;
* kontinualno tokom reakcije tzv. Fixed-time metodom baziranom na određivanju razlike između dve vrednosti merene u različitim vremenskim periodima. Prvo merenje se obavlja nakon 7,5 sekundi od dodavanja svih komponenti reakcije, a drugo merenje nakon inkubacije od npr. 6 min, 12 min tj. u skladu sa uputstvima testa. Prednost ovog metoda se ogleda u oduzimanju signala koji se javlja i u slučaju kada kompleksi antigena i antitela nisu formirani. Daljim dodavanjem antigena ili antitela može se proveriti da li je merenje vršeno u rastućem delu krive, što je slučaj kada dodavanje antigena rezultuje u povećanju signala ili ako dodavanje antitela ne dovodi do promena u signalu.
=== Imunoturbidimetrija ===
| |||