Cirkularni dihroizam

Cirkularni dihroizam (CD) zasniva se na različitoj apsorpciji desno i levo kružno polarizovane svetlosti koja je posledica strukturne asimetrije. Uređene strukture imaju CD signale dok neuređene nemaju. CD spektroskopija je metoda koja se koristi za utvrđivanje optičke izomerije molekula, a i za određivanje sekundarne i tercijarne strukture proteina.

Poreklo elipticiteta

Prikaz različite apsorpcije desno i levo kružno polarizovane svetlosti

Zbog asimetrične raspodele naelektrisanja kod optički aktivnih molekula, desno i levo kružno polarizovani talasi će se kretati različitim brzinama (zbog različitih indeksa prelamanja, n_D ≠ n_L). Kao posledica toga, fazni pomeraj između levo i desno kružno polarizovanog talasa posle prolaska kroz optički aktivnu sredinu će biti različit od onog pre prolaska kroz optički aktivnu sredinu, pa će ravan polarizacije linearno polarizovane svetlosti posle prolaska kroz optički aktivnu sredinu biti zakrenuta za određeni ugao u odnosu na ravan polarizacije linearno polarizovanog upadnog snopa. Ako su za datu optički aktivnu supstancu različiti i molarni apsorpcioni koeficijenti za desno i levo kružno polarizovanu svetlost (ε_D ≠ ε_L) izlazni snop će biti eliptično polarizovan.

Za datu talasnu dužinu, razlika između apsorbancije levo kružno polarizovane i desno kružno polarizovane svetlosti (ova veličina se obično meri):

$\Delta A=A_{L}-A_{D}\,$

Primenom Berovog zakona dobijamo sledeću zavisnost:

$\Delta A=(\epsilon _{L}-\epsilon _{D})Cl\,$

gde su:

ε_L i ε_D molarni apsorpcioni koeficijenti za levo kružno polarizovanu i desno kružno polarizovanu svetlost,

C molarna koncentracija

l dužina puta u centimetrima (cm).

Tada je:

$\Delta \epsilon =\epsilon _{L}-\epsilon _{D}\,$

molarni cirkularni dihroizam. Na ovu veličinu se najčešće misli pod pojmom cirkularni dihroizam supstance. Iako se često meri ΔA, uobičajeno je da se ekscentricitet eliptično polarizovane svetlosti izrazi veličinom koja se zove elipticitet (θ), θ = arctan (a/b). Da bi bilo moguće poređenje elipticiteta za uzorke različitih koncentracija potrebno je izraziti elipticitet po jedinici koncentracije, ili po broju rezidua. Zato se uvodi nova veličina - molarni elipticitet [θ].

Eliptično polarizovana svetlost (ljubičasta) je sastavljena od različitih doprinosa desno (plava) i levo (crvena) cirkularno polarizovane svetlosti

Molarni cirkularni dihroizam i molarni elipticitet, [θ], povezani su sledećom jednačinom:

$[\theta ]=3,298.2\Delta \epsilon \,$

Ova veza je izvedena iz definisanja elipticiteta polarizacije kao:

$tan\theta ={\frac {E_{D}-E_{L}}{E_{D}+E_{L}}}\,$

gde su E_D and E_L veličine vektora električnog polja desno-kružno i levo-kružno polarizovane svetlosti.

Kada je E_D jednako E_L (kada nema razlike u apsorpciji desno i levo-kružno polarizovane svetlosti), θ = 0° i svetlost je linearno polarizovana. Kada je ili E_D ili E_L jednako nuli, θ je 45° i svetlost je kružno polarizovana.

Kako je efekat cirkularnog dihroizma mali, odnosno tan θ ima malu vrednost i može se aproksimirati sa θ u radijanima. Intenzitet svetlosti, I, proporcionalan je kvadratu vektora električnog polja, tako da elipticitet postaje:

$\theta (radians)={\frac {(I_{D}^{1/2}-I_{L}^{1/2})}{(I_{D}^{1/2}+I_{L}^{1/2})}}\,$

Zatim možemo izraziti intenzitete u prethodnoj jednačini korišćenjem Berovog zakona u obliku prirodnog logaritma:

$I=I_{0}e^{-A\ln {10}}\,$

Elipticitet sada može biti napisan kao:

$\theta (rad)={\frac {(e^{{\frac {-A_{D}}{2}}ln10}-e^{{\frac {-A_{L}}{2}}ln10})}{(e^{{\frac {-A_{D}}{2}}ln10}+e^{{\frac {-A_{L}}{2}}ln10})}}={\frac {e^{\Delta A{\frac {ln10}{2}}}-1}{e^{\Delta A{\frac {ln10}{2}}}+1}}\,$

Kada je ΔA<<1, ovaj izraz može biti aproksimiran razvijanjem eksponencijalnih članova u Tejlorov red do prvog stepena (možemo zanemariti članove viših stepena) i zatim zanemarivanjem ΔA u poređenju sa jedinicom, kao i pretvaranjem radijana u stepene dobijamo sledeći izraz:

$\theta (deg)=\Delta A\left({\frac {ln10}{4}}\right)\left({\frac {180}{\pi }}\right)\,$

Linearna zavisnost koncentracije rastvora i dužine puta je uklonjena definisanjem molarnog elipticiteta kao:

$[\theta ]={\frac {100\theta }{Cl}}\,$

Onda kombinovanjem poslednja dva izraza sa Berovim zakonom, molarni elipticitet postaje:

$[\theta ]=100\Delta \epsilon \left({\frac {ln10}{4}}\right)\left({\frac {180}{\pi }}\right)=3,298.2\Delta \epsilon \,$

Molarni elipticitet zavisi od prirode supstance i talasne dužine upadnog zračenja.

Grafički predstavljena zavisnost molarnog elipticiteta neke supstancije od talasne dužine upadnog zračenja, [θ] = f(λ), zove se spektar cirkularnog dihroizma ili CD spektar date supstancije.

Primena na biološke molekule

Skoro svi biološki molekuli su optički aktivni. Kako se CD primenjuje na apsorpcione trake bilo kog optički aktivnog molekula, on će biti primenjen za biološke molekule, zbog desne rotacije (npr. neki šećeri) i leve rotacije (npr. neke aminokiseline) koju oni poseduju. Takođe možemo odrediti sekundarnu strukturu posmatranjem CD za dati molekul. Dakle, alfa heliks proteina i dupli (dvolančani) heliks nukleinskih kiselina imaju karakteristične CD spektre za svoje strukture.

CD je usko povezan sa tehnikom optičke rotacione disperzije (ORD), s tim što se CD smatra naprednijom tehnikom. CD se meri blizu apsorpcionih traka od interesa, dok se ORD može meriti daleko od ovih traka. Međutim, zbog disperzione prirode ORD, CD je osetljivija analitička metoda. U principu, ova dva merenja mogu biti povezana tzv. Konig-Kramerovim transformacijama, ako su sve apsorpcije obuhvaćene merenjem.

Ultraljubičasti CD spektar proteina može predvideti važne karakteristike njihove sekundarne strukture. Predikcija sekundarne strukture zasniva se na pretpostavci da je CD spektar proteina, zbog izrazite optičke aktivnosti peptidne hromofore, odraz njegove sekundarne strukture. Za peptidnu hromoforu karakteristični su n -> π* prelaz na 220nm i π -> π* prelaz na 190 nm. Procenu strukture proteina se vrši pomoću CD spektara sintetičkih polimera koji imaju strukturu 100 % α-heliksa, 100% β-ravni, 100% nasumičnog klupka (slučajna struktura) itd. Ova frakcionalna imenovanja važna su jer upućuju na moguće sekundarne konformacije u kojima može biti protein. Na primer, poli-L-lizin {(Lys)n} može usvojiti 3 različite konformacije samo za različite vrednosti pH i temperature: nasumično klupko na pH 7,0 ; α-heliks na pH 10,8 ; β-oblik na pH 11,1 posle zagrevanja do 52 °C i hlađenja.

CD spektar nepoznatog proteina = f_αS_α(λ) + f_βS_β(λ) + f_RCS_RC(λ), gde su S_α(λ), S_β(λ), i S_RC(λ) izvedene iz osnovnog spektra poli-L-lizina. Nedostatak ove metode je to što iako je lako dobiti vrednosti za S_α(λ), S_β(λ), i S_RC(λ) iz direktnih merenja, one nisu uvek usaglašene od jedne laboratorije do druge. Takođe, mora se uzeti u obzir i dužina lanca i uticaj agregatnog stanja ovog skupa baza spektra. Međutim, ovaj metod je obično tačan do 10% za sadržaj α-heliksa.

Na osnovu CD-a ne može se tačno reći na kom mestu u molekulu se dati α-heliksi nalaze, pa čak ni predvideti koliko ih ima. Uprkos ovome, CD je dragocen alat, naročito za pokazivanje konformacijskih promena. Na primer, može se koristiti za određivanje zavisnosti sekundarne strukture molekula od temperature ili koncentracije denaturisanih agenasa. Na taj način on može dati važnu termodinamičku informaciju o molekulu koja ne može inače biti lako dobivena. Bilo koji pokušaj ispitivanja proteina će dovesti do zaključka da je CD značajan za proveravanje da li je dati protein u svojoj nativnoj (savijenoj) konformaciji pre njegovog podvrgavanja skupim i/ili dugim eksperimentima.

Za određivanje sekundarne strukture, posmatraju se spektri u dalekoj UV oblasti (190-250 nm) i ukoliko je protein u nativnoj (savijenoj) konformaciji – peptidna veza će davati CD signal.

Za određivanje tercijarne strukture, posmatraju se CD spektri u bliskoj UV oblasti (250-350 nm) i ukoliko je protein u nativnoj konformaciji, CD signali će poticati od aromatičnih aminokiselina i disulfidnih mostova. Signali u oblasti od 250-270 nm potiču od fenilalanina, od 270-290 nm od tirozina i od 280-300 nm od triptofana. Disulfidne veze daju široke, slabe signale u celoj bliskoj UV oblasti. Ukoliko ne postoji nikakav signal u oblasti od 250-350 nm, znači da se protein ne nalazi u nativnoj konformaciji..

CD daje manje specifičnu informaciju o strukturi od npr. rendgeno-strukturne analize ili NMR spektroskopije proteina, koje daju podatke o atomima. Međutim, CD spektroskopija je brza metoda, koja ne zahteva velike količine proteina, niti dugu obradu podataka. CD se može koristiti za ispitivanje uslova rastvorljivosti, promene temperature, pH, jonske jačine i prisustva različitih faktora.

CD spektroskopija se obično koristi za proučavanje proteina u rastvorima, i kao dopunska metoda za proučavanje čvrstog stanja. Ovde takođe postoji ograničenje, jer se mnogi proteini ubačeni u membrane nalaze u svom nativnom stanju, pa su rastvori membrana nehomogeni zbog čega rasejavaju svetlost. CD se ponekad meri u tankim filmovima.

Eksperimentalna ograničenja

CD može da se koristi i za proučavanje ugljenih hidrata, ali sa ograničenim uspehom zbog teškoća povezanih sa snimanjem CD spektra u vakuum ultraljubičastoj (VUV) oblasti spektra (100-200 nm), gde odgovarajuće CD trake nesupstituisanih ugljenih hidrata leže. Spektri supstituisanih ugljenih hidrata sa trakama iznad VUV oblasti se uspešno snimaju .

Merenja CD-a takođe su komplikovana zbog činjenice da vodeni jonski puferski sistemi često apsorbuju u oblasti gde strukturne osobine pokazuju različitu apsorpciju kružno polarizovane svetlosti. Pri snimanju CD spektara fosfatnih, sulfatnih, karbonatnih i acetatnih jona moraju se koristiti veoma razblaženi rastvori. Borati i amonijum soli se često koriste za određivanje odgovarajuće pH oblasti za CD probe. Za povećanje jonske jačine, neki eksperimentatori zamenjuju hloridni jon fluoridnim, jer fluoridni jon apsorbuje manje u dalekoj UV oblasti, a neki rade u čistoj vodi. Drugi način da se minimizira apsorpcija rastvarača je primena užih ćelija, čime se smanjuje put svetlosti kroz ispitivani uzorak (obično kada se radi u dalekoj UV oblasti koriste se ćelije širina do 0,1 mm ).

CD spektri proteina korišćeni za procenu sekundarne strukture povezani su sa π - π* prelazima, koji su posledica apsorpcije amidne veze. Ove apsorpcione trake leže delimično u vakuumskoj ultraljubičastoj oblasti (talasne dužine manje od 200 nm). Oblast ove talasne dužine je nepristupačna zbog snažne apsorpcije kiseonika, tako da je snimanje na instrumentima oslobođenim od kiseonika (punjenim čistim gasom azotom) neophodno.

Kada je uklonjen kiseonik, drugi najvažniji tehnički faktor u radu ispod 200 nm je da ostatak optičkog sistema ima manje gubitke u ovoj oblasti. Zato treba koristiti aluminizirana ogledala čiji premazi su optimizirani za nizak gubitak u ovoj oblasti spektra.

Takođe je potrebno da se dostigne adekvatan odnos signal-šum (S/N je proporcionalno kvadratnom korenu dela vremena za koje se snima spektar). Zato je potrebno 30-60 min. da se snime spektri za određivanje sekundarne strukture (plus isti deo vremena za baznu liniju za svaki CD spektrometar).

Uobičajen izvor svetlosti u ovim instrumentima je kratko-lučna ksenonska lampa pod visokim pritiskom. Obične ksenonske lučne lampe su neprikladne za upotrebu u dalekoj UV oblasti. Umesto specijalno sagrađenih lampi sa omotima napravljenim od sintetike visoke čistoće, rastopljeni silikati moraju biti upotrebljeni. Svetlost sa izvora sinhrotrona ima mnogo veći fluks na kraćim talasnim dužinama i korišćena je za CD ispod 160 nm.

Na nivou kvantne mehanike, sadržaj informacija CD-a i optičke rotacije je identičan.

Literatura

• Fasman, G.D. (1996). Circular dichroism and Conformational Analysis of Biomolecules. New York: Plenum press. 
• A. Popović-Bijelić, M. Mojović (2007). Praktikum iz biofizičke hemije. Beograd: Univerzitet u Beogradu- Fakultet za fizičku hemiju. 
• Hecht, E. (1998). Optics (3rd izd.). Massachusetts. 

Spoljašnje veze

• Circular Dichroism explained - A commercial supplier's site, but very good information with examples, etc.
• Circular Dichroism at UMDNJ Arhivirano 2009-04-29 na Wayback Machine-u - a good site for information on structure estimation software
• Electromagnetic waves Arhivirano 2007-04-22 na Wayback Machine-u - Animated electromagnetic waves